PCR反應五要素：
參加PCR反應的物質(zhì)主要有五種即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+
引物： 引物是PCR特異性反應的關鍵，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其設計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增。
特點優(yōu)勢：
1.特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學分析，經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段，可實現(xiàn)對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到佳 。
2. 重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實驗菌株的驗證，重現(xiàn)性為佳 。
3. 靈敏性：該系列產(chǎn)品可實現(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測，當樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時，可實現(xiàn)對其的直接檢測，無需繁瑣的增菌過程。
4. 實用性：檢測范圍廣，涵蓋了對人體危害較為嚴重的17種呼吸道及腸道致病菌，可實現(xiàn)對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測，整個檢測過程為3-4個小時。
5. 優(yōu)勢1：序列資源豐富，除GenBank公布的序列外，公司還進行了大量菌株的序列破譯，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。
6. 優(yōu)勢2：該系列試劑盒均經(jīng)過大量的保守性及特異性實驗驗證，憑借公司擁有的豐富的菌種資源，每一種檢測試劑盒均經(jīng)過了20余種標準菌株和臨床菌株的保守性驗證及40余種近緣標準菌株和臨床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會出現(xiàn)任何的假陽性及假陰性報告結果。
RNA和DNA提?。?/span>
裂解：裂解公式可能因您要提取 DNA 還是 RNA 而異，但共同點是含有高濃度離液鹽的裂解緩沖液。
Chaotropes（離液劑）的作用：Chaotrope會破壞氫鍵及疏水間的相互作用。離液鹽包括鹽酸胍、硫氰酸胍、尿素和高氯酸鋰。
洗滌劑：除了離液劑外，裂解緩沖液中通常還有一些去污劑，以幫助蛋白質(zhì)溶解和裂解。
溶jun酶和蛋白酶K:根據(jù)樣品類型，也可以使用酶進行裂解。蛋白酶 K 就是其中之一，實際上在這些變性緩沖液中效果較 好；當?shù)鞍踪|(zhì)變性增多，蛋白酶 K 的作用也會相應增強。然而，溶jun酶在變性中不起作用，因此溶jun酶處理通常在添加變性鹽之前進行。
提取步驟：
1.從負八十冰箱取出樣品，放置于冰上緩慢解凍； （提前預冷離心機至4度）
2.待解凍后（紅色），加入200 μl氯仿（加入氯仿體積為Trizol體積的1/5），劇烈震蕩（乳白紅色），冰上靜置10 min。 （氯仿為有機溶劑，有效的使有機相和無機相迅速分離。有機相中主要是酚和蛋白結合，從而使得蛋白和RNA脫離，RNA進入水相。）
3.放置于預冷離心機，離心（4度，12000 rpm，15 min），離心后可見明顯分三層（上層無色透明水相為RNA層，中間很薄的乳白色為DNA層，下層為紅色為蛋白層）。
4.小心緩慢吸取上清，約400 μl（寧可少吸，也不要多吸?。?，置于另一個新的1.5 ml RNase-free EP管中，加入等體積的異丙醇，上下顛倒混勻，常溫靜置放置15 min。
5.離心（4度，12000 rpm，15 min），可見白色沉淀（有時細胞較少看不到沉淀，可放置負二十或負八十兩小時再繼續(xù)后面步驟）
6.棄上清，每管加入950 ul 75% 乙醇，上下顛倒混勻（切記不要用槍吹打混勻，這樣會造成RNA溶解）。
7.離心（4度，12000 rpm，10 min），可見底部明顯白色沉淀。
8.離心后，棄掉上清，放入離心機再次瞬離，用10 μl 的移液器洗去殘留液體， 開蓋晾干（約5 min）。
9.每個樣品根據(jù)沉淀大小加入適量DEPC水（一般20~30 μl，有時看不到沉淀，可加10 μl DEPC水溶解），吹打溶解RNA，十一樓酶標儀測濃度，OD值（260/280=1.8-2.0）標記，負八十保存。
備注：對于中性粒細胞提取RNA建議細胞數(shù)目大于2x106/樣品；
備注：操作過程中佩戴口罩。
設計引物應遵循以下原則：
①引物長度： 15-30bp，常用為20bp左右。
②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜，特定條件下可擴增長至10kb的片段。
③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶。ATGC好隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結構，避免兩條引物間互補，特別是3’端的互補，否則會形成引物二聚體，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。
⑤引物3’端的堿基，特別是 末及倒數(shù) 個堿基，應嚴格要求配對，以避免因末端堿基不配對而導致PCR失敗。
⑥引物中有或能加上合適的酶切位點，被擴增的靶序列 有適宜的酶切位點，這對酶切分析或分子克隆很有好處。
⑦引物的特異性：引物應與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性。
注意事項:
1． 試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。
2.各步加樣均應使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，推薦使用排槍加樣。
3.請每次測定的同時做標準曲線，做復孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔di一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請再乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
4.封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
5.底物請避光保存。
6.嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
7.所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。
8.本試劑不同批號組分不得混用。
9.不能使用過期產(chǎn)品。
10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。
