【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近日，大連化物所生物技術(shù)研究部分子探針與熒光成像研究組(1818組)徐兆超研究員團(tuán)隊(duì)發(fā)展雙色單分子閃爍比率成像技術(shù)(2C-SMBR)，在單溶酶體水平同步實(shí)現(xiàn)納米級(jí)結(jié)構(gòu)成像與腔內(nèi)pH準(zhǔn)確定量。
 

　　溶酶體作為細(xì)胞的“化工廠”與“信號(hào)樞紐”，其功能高度依賴(lài)于腔內(nèi)pH的精確調(diào)控。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，溶酶體是均質(zhì)的酸性細(xì)胞器(pH=4.5至5.0)，然而，近年研究提示其存在功能異質(zhì)性。例如，黑色素細(xì)胞中的黑素體、免疫細(xì)胞中的分泌性溶酶體均具有獨(dú)特的pH特征，甚至同一細(xì)胞內(nèi)的經(jīng)典溶酶體也可能因空間位置、運(yùn)動(dòng)狀態(tài)差異而承擔(dān)不同功能。
 

　　解析上述異質(zhì)性的核心挑戰(zhàn)在于技術(shù)手段的缺失——傳統(tǒng)群體測(cè)量方法(例如熒光探針比率成像)只能提供細(xì)胞器群體的平均pH值，無(wú)法揭示單溶酶體水平的動(dòng)態(tài)差異；而基于單分子定位的超分辨成像雖能追蹤單個(gè)溶酶體的運(yùn)動(dòng)與形態(tài)，卻難以同步測(cè)試腔內(nèi)pH。徐兆超團(tuán)隊(duì)此前開(kāi)發(fā)的LysoSR-549探針(Angew. Chem. Int. Ed.，2022)和Aze-HMSiR(Angew. Chem. Int. Ed.，2025)，可通過(guò)pH依賴(lài)的自發(fā)閃爍特性，在單溶酶體水平關(guān)聯(lián)動(dòng)態(tài)行為與相對(duì)pH變化。然而，其依賴(lài)單色熒光光子數(shù)的測(cè)量方法易受實(shí)驗(yàn)條件(如激發(fā)光強(qiáng)度、探針負(fù)載量)等環(huán)境因素影響，導(dǎo)致單個(gè)溶酶體中pH測(cè)量不夠準(zhǔn)確。
 

　　在本工作中，研究團(tuán)隊(duì)發(fā)展的2C-SMBR技術(shù)基于兩種pH響應(yīng)特性互補(bǔ)的自發(fā)閃爍熒光探針：通過(guò)單分子定位顯微術(shù)(SMLM)分別解析兩種探針的空間分布，可重建溶酶體的納米級(jí)結(jié)構(gòu)(分辨率10nm)；同時(shí)，利用雙色探針閃爍動(dòng)態(tài)的比率分析(如頻率、持續(xù)時(shí)間等參數(shù))，消除探針濃度、光漂白等干擾因素，實(shí)現(xiàn)單溶酶體pH的精準(zhǔn)定量。該技術(shù)將單分子定位的超高空間分辨率與比率分析的抗干擾性相結(jié)合，傳統(tǒng)方法依賴(lài)雙色信號(hào)的空間疊加，而2C-SMBR通過(guò)時(shí)間分辨的單分子事件關(guān)聯(lián)，確保信號(hào)源自同一溶酶體，從而在納米尺度上同步實(shí)現(xiàn)結(jié)構(gòu)成像與功能量化。該技術(shù)pH測(cè)量動(dòng)態(tài)范圍可擴(kuò)展至4.0至6.0，為活細(xì)胞器功能異質(zhì)性研究提供了兼具精度與可靠性的新工具。
 

　　團(tuán)隊(duì)?wèi)?yīng)用2C-SMBR技術(shù)，取得了一系列新發(fā)現(xiàn)：首先，溶酶體pH在單細(xì)胞水平呈現(xiàn)高度異質(zhì)性，單個(gè)細(xì)胞內(nèi)同時(shí)存在pH跨度達(dá)2.0的溶酶體亞群(pH=4.0至6.0)，其中核周溶酶體平均pH為4.88，而外圍溶酶體平均pH達(dá)5.64，且高pH溶酶體運(yùn)動(dòng)速度更快、更易形成動(dòng)態(tài)簇集；其次，溶酶體動(dòng)態(tài)行為與pH變化存在實(shí)時(shí)耦合，單個(gè)溶酶體的pH實(shí)時(shí)發(fā)生動(dòng)態(tài)波動(dòng)，溶酶體運(yùn)動(dòng)停頓過(guò)程可能擔(dān)任溶酶體pH變化的拐點(diǎn)。此外，當(dāng)細(xì)胞堿化后大部分外圍溶酶體會(huì)向核周中心體附近聚集形成新的亞群。
 

　　相關(guān)研究成果以“Two-Color Single-Molecule Blinking Ratiometricity: A Functional Super-Resolution Imaging Approach for Resolving Lysosomal pH and Dynamics”為題，發(fā)表在《德國(guó)應(yīng)用化學(xué)》(Angewandte Chemie International Edition)上。該工作的第一作者是我所1818組喬慶龍副研究員。上述工作得到國(guó)家自然科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院穩(wěn)定支持基礎(chǔ)研究領(lǐng)域青年團(tuán)隊(duì)計(jì)劃、我所創(chuàng)新基金等項(xiàng)目資助。(文/圖 喬慶龍、徐兆超)